用富集15N的N2、无机或有机肥料为示踪剂或利用15N天然丰度的变异，根据固氮体对15N的吸收，测定生物N2固定的方法。同位素法的最大优点是能区分固氮植物来自土壤、肥料和大气的氮，是唯一能直接测定生物固氮量的方法。比凯氏定氮法准确、灵敏，能克服乙炔还原法的不足，还能在田间条件下测定固氮作物的实际固氮力。15N测定生物固氮有下列四种方法。

15N还原法 利用固氮微生物对N2的还原作用，将固氮体系直接暴露在含有15N2的密封气相系统一段时间，然后取样分析。如果发现固氮体系有15NH3或其他15N-富集的衍生物，即证明有固氮作用发生。由下列公式计算固定的氮量：

式中 TN为固氮体总氮量 ......